英瀚斯生物為您整理免疫組化實驗步驟

1、石蠟切片置于65℃烘箱中烘片2h，脫蠟至水，用PBS沖洗三次，每次5min。

2、切片置于EDTA緩沖液中微波修復，中火至沸后斷電，間隔10min低火至沸。

3、自然冷卻后PBS洗3次，每次5min。4、切片放入3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10min，以阻斷內源性過氧化物酶。

5、PBS洗3次，每次5min，甩干后5%BSA封閉20min（封閉電荷）。

6、去除BSA液，每張切片加入50μl稀釋的一抗覆蓋組織，4℃過夜。

7、PBS洗3次，每次5min。

8、去除PBS液，每張切片加50μl-100μl相應種屬的二抗，4℃孵育50min。

9、PBS洗3次，每次5min。

10、去除PBS液，每張切片加50-100μl新鮮配制DAB溶液，顯微鏡控制顯色。

11、顯色完全后，蒸餾水或自來水沖洗，蘇木素復染，1%鹽酸酒精分化（1s），自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗。

12、切片經過梯度酒精（70-100%）10min一個梯度，脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。 做免疫組化意味什么？浙江小鼠免疫組化要多少錢

免疫組化實驗所用的組織和細胞標本是什么樣的？

實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標本**常用、**基本的方法，對于組織形態保存好，且能作連續切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中優先的組織標本制作方法。

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細胞屬性的判定，免疫組化也可以進行這方面的臨床應用。通過特定抗體標記出細胞內相應的抗原成分，來判定細胞的屬性，確定cancer的來源。如細胞角蛋白(CK)是上皮性標記，CK陽性提示cancer為上皮源性cancer;降鈣素抗體是甲狀腺髓樣cancer特有的標記;甲狀腺球蛋白(Tg)陽性提示是甲狀腺濾泡性cancer;前列腺特異性抗原(PSA)只見于前列腺上皮;膠質纖維酸性蛋白(GFAP)陽性則提示膠質cancer;CD20和CD79a陽性則提示B細胞淋巴瘤;平滑肌肌動蛋白(Actin)陽性提示cancer為平滑肌源性;胃腸道間質瘤中原cancer基因蛋白產物CD117陽性;血管源性cancer中內皮細胞標記物CD34陽性等等。如果您需要做實驗外包，可以與我們英瀚斯生物進行聯系。

免疫組化的抗原修復

很多抗原的可視性可以通過抗原修復來提高，抗原修復可以打破福爾馬林固定時形成的蛋白質交聯，從而使被掩藏的抗原顯現出來。抗原修復技術包括不同時間長度的加熱或者利用蛋白酶來做酶消化，例如蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。加熱的方法通常會用到微波爐，高壓鍋，蒸箱或水浴。將樣品在接近100°C高溫加熱20分鐘后再冷卻同等的時間。**常用的抗原修復液有a)檸檬酸鹽緩沖劑,pH6.0,b)Tris-EDTA,pH9.0和c)EDTA,pH8.0.如需要可用檸檬酸鹽緩沖劑做抗原修復：檸檬酸鹽緩沖劑配方:10mM檸檬酸鈉,0.05%Tween-20,pH6.0或10mM檸檬酸,0.05%Tween-20,pH6.0將含有檸檬酸鈉或檸檬酸鹽緩沖劑的染色盤放到蒸箱或者水浴中，預熱到95-100°C。將切片浸沒于染色盤中。蓋子虛掩，孵育20-40分鐘(研究者需自己決定比較好的孵育時間)。關掉蒸箱或水浴，將染色盤置于室溫下，讓切片冷卻20分鐘。在TBS-Tween-20中漂洗切片2次，每次2分鐘。開始封閉步驟。 常見的免疫組化方法有哪些？

免疫組化的優缺點

免疫組化的優點在于其高特異性和敏感性，能夠在組織原位檢測目標蛋白的表達和分布。此外，免疫組化可以與其他技術（如熒光顯微鏡、電子顯微鏡）結合，提供更豐富的信息。然而，免疫組化也存在一些缺點。首先，實驗步驟復雜，需要優化多個參數（如一抗濃度、孵育時間）。其次，免疫組化的結果可能受到組織固定、抗原修復等因素的影響，導致假陽性或假陰性結果。此外，免疫組化的定量分析相對困難，通常只能進行半定量分析。 英瀚斯生物，組織包埋、切片、染色、免疫組化拍照、報告分析，一站式搞定！免疫組化是什么

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免疫組化結果要如何分析？

 （1）陽性著色細胞計數法。在40*光鏡下，隨機選擇不重疊的10個視野，機器或人工計數陽性著色細胞，每組3~6張不同動物組織切片，然后進行組間比較即可。

（2）灰密度分析法。可以通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區域、相同條件下用image j進行灰密度分析，然后進行統計分析即可。

（3）評分法。用光學顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0~3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進行評分（1~4分為0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），**終可以分數相加，再進行比較。對于以上這幾種方法，各有利弊，請細心選擇。要想得到正確結果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質量切片。

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