原代細胞應用困局：經過一次傳代后，原代細胞培養物就會成為二級細胞培養物，也稱為細胞株。然而，盡管稱為細胞株，但其壽命是有限的（除非如前所述永生化）。這種有限的分裂能力體內的細胞相似，一旦細胞在體內完全分化以發揮其特殊功能，細胞將停止增殖-這是固有的保護性衰老過程。此外，某些原代細胞有絲分裂后，無論是在體內或體外培養中都不增殖（例如，神經元，骨骼肌細胞，心肌細胞，周細胞，終末分化的肝細胞）。因此，每次進行實驗后，原代細胞培養都需要再次從新鮮的組織中解離。給培養液中加入低濃度的透明質酸復合物。在有攪拌裝置的培養器皿內加入培養液。杭州廣州原代細胞分離試劑盒

原代細胞培養注意事項：1.收到細胞時，要鏡下觀察是否有污染情況；收到細胞的前幾天，要做好各種倍數的鏡下拍照記錄，以防細胞出現問題后，可以跟公司很好地溝通。2.收到細胞后，不要馬上處理。應置于培養箱中靜置4h以上再操作。如果不著急，可靜置過夜。3.細胞的靠前次傳代，一定要密度高一些傳代，原代細胞傳代密度低，很難長起來。建議1:2-1:3傳代。4.原代細胞傳代時（內皮細胞，貼壁為例），0.25%+0.53nM的胰酶消化，1ml消化液37度培養箱內消化30sec，再加入5ml培養基（正常消化貼壁細胞，我們使用胰酶和培養基的量是1:1，但是原代細胞必須用大量培養基中和胰酶）。5.原代細胞不建議凍存，因為凍存很容易復活不成功。如果要凍存的話，建議在P2或P3代凍存，凍存液中的血清越多越好，建議比例9（血清）:1（DMSO）。6.原代細胞復蘇時，置于37-38度水浴融化細胞，并加入10ml培養液（正常貼壁細胞復蘇時，也可以使用這種比例，復蘇成活率會較大提高），離心重懸鋪板。貴陽正規原代細胞分離試劑盒銷售廠家相關研究工作已經揭示了生長培養基必須包含的基本成分。

原代細胞培養問題：1、細胞培養過程中，多久更換一次培養基這取決于細胞生長的速度。一般而言2-3天更換一次培養基，許多細胞培養實驗室通常在周一，周三，周五更換培養基。注意：凍存細胞復蘇后，在6-16小時內更換培養基，以去除殘留的二甲基亞楓和死亡的細胞。2、我能擴增培養和再次凍存原代正常人類細胞嗎？這取決于細胞的類型。一些細胞類型像神經細胞，神經膠質細胞和一些生長緩慢的上皮細胞，不推薦擴增培養和再次凍存。其它的細胞類型像成纖維細胞、星形細胞、腎系膜細胞、星形膠質細胞等等，可以擴增培養和再次凍存。然而，需要注意的是再次凍存的過程可能導致細胞生長性能的改變。3、培養瓶中應該加入多少體積的培養基？我們推薦的用量為：T-25培養瓶5ml，T-75培養瓶15ml，T-150培養瓶30ml。

懸浮型原代細胞：1）必須保持細胞的懸浮狀態。可以通過增加培養液的黏度來幫助細胞呈懸浮狀態，如給培養液中加入低濃度的透明質酸復合物。在有攪拌裝置的培養器皿內加入培養液是，以5ml為較低限度，否則攪拌時會產生氣泡對細胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過快，否則即可使培養液溢出又容易造成污染。如果培養液的量在5ml以下，可以采用旋轉瓶培養。給懸浮培養的細胞換液時要注意不要吸出細胞2）能夠進行懸浮培養的細胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營養成分消耗大，換液時間隔一般較短。培養時間無論是酶消化法還是組織塊法。

細胞傳代的方法都有哪些：根據不同的細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細胞用直接吹打即可傳代；懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。原代培養的開始傳代應注意的問題？細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代；原代培養時細胞多為混雜生長，不同的細胞有不同的消化時間，因此要根據需要注意觀察及時處理，并根據不同細胞對胰蛋白酶的耐受時間而分離和純化所需要的細胞；吹打細胞時動作要輕巧盡可能減少對細胞的損傷；開始傳代時細胞接種數量要多一些，使細胞能盡快適應新環境而利于細胞生存和增值；隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養瓶應該添加額外的組織特異性因子，以防止成纖維細胞的生長。蕪湖正規原代細胞分離試劑盒

永生化細胞系通常具有更快的倍增時間并可持續地分裂。杭州廣州原代細胞分離試劑盒

原代細胞的獲取：1.培養時間無論是酶消化法還是組織塊法，取樣后培養時間較少需要一周以上的時間，期間可換液或者傳代。2.換液時間無論酶消化法還是組織塊法，在培養期間需要隨時關注細胞的生長狀況，需觀察其是否貼壁，是否污染，組織塊法要觀察是否有細胞遷移出來。正常情況下48~72h可換液一次。3.細胞狀態判斷正常貼壁細胞在培養幾天后，會逐漸貼滿整個瓶底或者皿底，有的呈纖維狀，有的呈多邊形。下圖均為比較健康的原代細胞圖（左：小鼠成纖維細胞；右：雞胚成纖維細胞；下：人成纖維細胞）。杭州廣州原代細胞分離試劑盒