細胞培養注意事項及常見問題解答：傳代1、貼壁細胞傳代時，先用消化液潤洗一遍；棄掉后，再加入適量消化液置于孵箱或鏡下觀察消化；當細胞變圓，彼此之間產生空隙，加入等量或大量的培養基終止消化，培養基中的血清可以克制胰蛋白酶的活性。2、這里我沒有明確提到胰蛋白酶的濃度，并不是說濃度越高越好。胰蛋白酶底物的特異性差，會破壞細胞膜成分。PH8.0，37度環境下，消化液的消化能力是較強的。培養基中的血清會降低胰酶的消化能力，所以每次消化前，也要用PBS反復沖洗干凈培養皿。日常用的比較多的消化液濃度：a)0.25%胰蛋白+0.02%EDTA。當細胞向外遷徙出來后要注意記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細胞。正規原代細胞分離試劑盒廠家現貨

原代細胞標準化培養：由于每種原代細胞培養的條件迥異，而且每個實驗室都摸索出自己的培養條件，而對于一個特定的組織塊，所用培養條件不一樣，得出的所需細胞族群就不一樣，因為每種組織塊都含有不同種類的細胞群，而每一種細胞群在所選定的培養條件下（比如所選蛋白分解酶的種類和條件，細胞因子的種類，基礎培養基的種類或者是培養時間長短）都會得出不同的結果。由于各實驗室采取不同的培養條件，即使是同一塊心組織就有可能造成A實驗室獲得30%的心肌細胞，70%其他種類細胞，而B實驗室卻能獲得70%所需心肌細胞，30%為成纖維、脂肪等種類。這樣的話，即使是做同一項目的實驗，就有可能得出相反的科學結論。因此，早在2004年，美國科學界就質疑之前以原代細胞為主的科研文章，并同時提出原代細胞標準化培養的概念濟南正規原代細胞分離試劑盒生產廠家給培養液中加入低濃度的透明質酸復合物。在有攪拌裝置的培養器皿內加入培養液。

原代細胞的獲取：1.培養時間無論是酶消化法還是組織塊法，取樣后培養時間較少需要一周以上的時間，期間可換液或者傳代。2.換液時間無論酶消化法還是組織塊法，在培養期間需要隨時關注細胞的生長狀況，需觀察其是否貼壁，是否污染，組織塊法要觀察是否有細胞遷移出來。正常情況下48~72h可換液一次。3.細胞狀態判斷正常貼壁細胞在培養幾天后，會逐漸貼滿整個瓶底或者皿底，有的呈纖維狀，有的呈多邊形。下圖均為比較健康的原代細胞圖（左：小鼠成纖維細胞；右：雞胚成纖維細胞；下：人成纖維細胞）。

原代細胞培養的開始傳代：原代培養后由于懸浮細胞增殖，數量增加甚至達飽和密度;貼壁細胞的相互匯合，使整個瓶底逐漸被細胞覆蓋，細胞難以繼續生長繁殖，需要進行分瓶培養，這種使原代細胞經分散接種的過程稱之為傳代。值得注意的是：每次傳代細胞在生長和增殖方面受到一定的影響。開始傳代應注意以下幾點：①細胞生長密度不高時，不能急于傳代。②原代培養的貼壁細胞需控制消化時間。③吹打已消化的細胞應減少機械損傷。④開始傳代時細胞接種數量要多一些。⑤開始傳代培養的pH應偏低些。小牛血清濃度可加大至15%～20%左右。用專門的原代細胞培養基進行培養，較大限度提高原代細胞的生長。

細胞凍存：通常我們不推薦重新凍存原代細胞，因為這可以促進細胞衰老和/或導致功能變化。原代細胞非常敏感，重新凍結可能導致細胞死亡或損傷。與細胞系不同，原代細胞增殖有限，我們建議盡早使用原代細胞進行實驗以防止遺傳漂移，如果你正在使用一個增殖困難的細胞類型，你應該密切監測細胞形態，因為少量混雜的細胞（如成纖維細胞）可能隨著時間的推移，大量生長從而成為主要細胞。正常的原代細胞培養，在無污染的情況下，建議培養基中不加抗體，抗體會影響細胞的某些基因變異從而導致實驗數據有差異，所以cellsystems的細胞在分離提取時就考慮到這點，他們不會采用任何抗體去分離和純化的同時，通過酶消化或者離心洗滌的方法讓細胞達到95%以上的純度，這樣得到的實驗數據更為準確。給懸浮培養的細胞換液時要注意不要吸出細胞。無錫貴陽原代細胞分離試劑盒

培養時間無論是酶消化法還是組織塊法。正規原代細胞分離試劑盒廠家現貨

原代細胞的培養條件：靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養)培養：a.細胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性。b.細胞接種時濃度要稍大一些，至少為5×108細胞/L。c.培養基可用Eagle(MEMCorning10-010-CVR)或DMEM(Corning10-013-CVR)培養。d.胎牛血清濃度為10%-80%。e.應在37℃5%CO2的培養箱中培養。f.在起始的2天中盡量減少振蕩，以防止剛貼壁的細胞發生脫落，漂浮。g.待細胞基本貼壁伸展并逐漸形成網狀，應將原代細胞換液。h.用骨髓或外周血中的懸浮細胞經靜置培養1周時，應將細胞懸液經低速離心后換液。正規原代細胞分離試劑盒廠家現貨