置于37°培養(yǎng)箱。每15min搖晃一次，消化時間根據(jù)組織來定，約1-2h；5.待大部分組織塊消化成透明狀時，用40μm的細胞濾網(wǎng)過濾細胞，收集；6.用培養(yǎng)基重懸，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。常見問題解答：Q：為什么我取得原代組織，分離的卻不是細胞？A：取材時，我們要熟悉所需組織的類型和部位特征，選擇細胞集中、活力較好的部分。避免結(jié)締等正常組織。Q：若是細胞中混成纖維細胞，如何去除？A：成纖維細胞的去除對于細胞培養(yǎng)十分重要。由于成纖維細胞貼壁速度較細胞快，可利用反復(fù)貼壁法使二者分離，進而達到成纖維細胞的目的。Q：為什么離心后，沒有細胞分離出來？A：需要考慮消化酶的因素，由于組織較致密，胰酶無法消化，一般選用膠原酶，如膠原酶Ⅳ。若是組織十分致密可以再結(jié)合機械法，如研磨或者攪拌加速細胞分散。如下表為二者的區(qū)別：膠原酶胰酶來源細菌胰臟消化組織纖維多的硬組織軟組織對細胞影響傷害小長時間有損傷作用力度緩和強注：膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞膠原酶，根據(jù)分離的組織類型需選擇合適的膠原酶類型。Q：消化時間如何確定？A：具體的消化酶的量和消化時間可根據(jù)組織類型和多少進行調(diào)整。Q：消化之前為什么用EDTA?A：EDTA是一種非酶消化物。將動物某組織在合適的操作中培養(yǎng)出特定細胞，使得目的細胞得以生存、生長和繁殖，稱為原代細胞分離培養(yǎng)。內(nèi)蒙古大鼠原代細胞

使得初學(xué)者或不熟練的實驗人員在用爬片法制備原代細胞時，會造成污染或?qū)嶒炂鞑?實驗動物)的浪費，損失人力，物力，財力。這就急需一個出色的一體式原代細胞爬片培養(yǎng)瓶來滿足上述實驗需求。申請人根據(jù)多年的提取原代背根神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)細胞和血管平滑肌細胞的經(jīng)驗,創(chuàng)造性、開拓性的設(shè)計了一種一體式原代細胞爬片培養(yǎng)瓶。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的為了解決現(xiàn)有培養(yǎng)瓶(皿)進行原代細胞爬片培養(yǎng)存在的許多不便和不足之處，故提出一種操作方便，結(jié)構(gòu)設(shè)計合理，有助于爬片法制備原代細胞的培養(yǎng)瓶。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案：一種一體式原代細胞爬片培養(yǎng)瓶，包括瓶身，所述瓶身的其中一側(cè)端部設(shè)有爬片瓶頸和加樣口，瓶身的上端部設(shè)有外接圓柱，所述外接圓柱的頂端封閉、下端與瓶身連通，并且外接圓柱內(nèi)設(shè)有活動圓盤和纖維圓盤，所述活動圓盤位于纖維圓盤的上方，活動圓盤的四周外壁與外接圓柱的內(nèi)壁可滑動接觸，并且在外接圓柱內(nèi)壁上設(shè)有用于限制活動圓盤向上活動的阻隔環(huán)，同時在外接圓柱位于活動圓盤上方的柱體上設(shè)有正壓口，所述纖維圓盤固定設(shè)置，并且在纖維圓盤內(nèi)可活動穿插有連接桿，所述連接桿上端與活動圓盤固定連接。湖北哪里有原代細胞外包本公司分離的SD大鼠間充質(zhì)干細胞取自新鮮的組織材料，并且按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進行原代細胞的分離和培養(yǎng)。

本發(fā)明采用活塞式推進桿外加正壓式肝素帽設(shè)計，增強了瓶身的一體性，減少了污染的可能性，且通過注射器注水的方式可以自行控制纖維板和培養(yǎng)瓶底部的接觸程度，使得操作流程更可控。附圖說明圖1是本發(fā)明的整體結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是本發(fā)明的縱向剖面結(jié)構(gòu)示意圖。圖中標(biāo)記為：1-外接圓柱；2-正壓口；3-阻隔環(huán)；4-彈簧；5-連接桿；6-加樣口；7-爬片瓶頸；8-纖維板；9-瓶底；10-直角三角支架；11-活動圓盤；12-纖維圓盤；13-瓶身。具體實施方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。如圖1和2所示，一種一體式原代細胞爬片培養(yǎng)瓶，包括瓶身13，所述瓶身13的其中一側(cè)端部設(shè)有爬片瓶頸7和加樣口6，瓶身13的上端部設(shè)有外接圓柱，所述外接圓柱1的頂端封閉、下端與瓶身13連通，并且外接圓柱1內(nèi)設(shè)有活動圓盤11和纖維圓盤12，所述活動圓盤11位于纖維圓盤12的上方，活動圓盤11的四周外壁與外接圓柱1的內(nèi)壁可滑動接觸，并且在外接圓柱1內(nèi)壁上設(shè)有用于限制活動圓盤11向上活動的阻隔環(huán)3，同時在外接圓柱1位于活動圓盤11上方的柱體上設(shè)有正壓口2，所述纖維圓盤12固定設(shè)置，并且在纖維圓盤12內(nèi)可活動穿插有連接桿5，所述連接桿5上端與活動圓盤11固定連接。

如果接種的細胞密度過低，細胞之間的促生長作用很小，也很難使細胞適應(yīng)從體內(nèi)的組織環(huán)境到被分散后進入生存環(huán)境的變化過程。如果接種的細胞密度過大，會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，代謝廢物積累較快需要經(jīng)常換液和傳代。2）適當(dāng)增大原代培養(yǎng)接種的細胞密度，給培養(yǎng)的細胞提供更多的類似于在體內(nèi)時細胞之間的相互作用，會極大提高原代培養(yǎng)的細胞在體外存活率。待細胞適應(yīng)體外環(huán)境后進行傳代培養(yǎng)時再以較低的密度接種和培養(yǎng)。3）盡快使接種的細胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。可以在接種后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h到5h，待細胞貼壁后，再補足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。3、懸浮型原代細胞1）必須保持細胞的懸浮狀態(tài)。可以通過增加培養(yǎng)液的黏度來幫助細胞呈懸浮狀態(tài)，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液是，以5ml為限度，否則攪拌時會產(chǎn)生氣泡對細胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過快，否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細胞換液時要注意不要吸出細胞。2）能夠進行懸浮培養(yǎng)的細胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營養(yǎng)成分消耗大。骨骼肌的一般形態(tài)特征肌細胞呈纖維狀，不分支，有明顯橫紋，核很多，且都位于細胞膜下方。

易操作原代細胞和細胞系的比較3.原代細胞的應(yīng)用由于原代細胞生物學(xué)特性未發(fā)生很大改變，接近和反映體內(nèi)生長特性，因此是：(1)研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的工具；(2)更好實現(xiàn)醫(yī)診治模式，實現(xiàn)個體化用藥的目的。第二部分：原代細胞分離和培養(yǎng)技術(shù)原代培養(yǎng)的原理將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶/膠原酶)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。主要包括取材——分離——培養(yǎng)等3部分；在原代細胞應(yīng)用較多的包括：組織（如實體瘤、皮膚等）、懸浮細胞的取材等。下面依次介紹：一、組織的取材病人自體的原代細胞由于更接近臨床患者標(biāo)本，可以更好實現(xiàn)醫(yī)療的診治模式，實現(xiàn)個體化用藥的目的。所以對病人自體細胞體外分離與培養(yǎng)十分必要。基本過程如下圖所示：原代細胞的分離步驟備注：上圖細胞為肉瘤患者的原代細胞具體步驟如下：1.在無菌條件下的冰上對新鮮離體的組織，剔除包膜及壞死組織，無菌PBS清洗3-5次；切成約1mm3組織塊；2.加入2mmol的EDTA，搖勻后放置冰上約30-60min；3.離心，并加入膠原酶消化（含蛋白酶）；4.消化期間，置于37°培養(yǎng)箱。由于臍帶是分娩過程中的廢棄物，同時從臍帶中分離人臍靜脈平滑肌細胞方法相對成熟。內(nèi)蒙古原代細胞實驗室

當(dāng)細胞融合度達到90%以上時，給細胞傳代。內(nèi)蒙古大鼠原代細胞

作為本實用新型所述的一種可以分離的細胞培養(yǎng)板的一方案，其中：所述底座底部固定安裝有支撐腳架。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實用新型的有益效果是：通過該一種可以分離的細胞培養(yǎng)板的設(shè)置，結(jié)構(gòu)設(shè)計合理，通過底座、一號培養(yǎng)板、梯形卡槽、二號培養(yǎng)板、梯形卡塊和固定螺絲的配合，實現(xiàn)了方便拆卸，且連接更加穩(wěn)定，通過橫向標(biāo)尺和縱向標(biāo)尺的配合，方便標(biāo)號對比，提高了效率。附圖說明為了更清楚地說明本實用新型實施方式的技術(shù)方案，下面將結(jié)合附圖和詳細實施方式對本實用新型進行詳細說明，顯而易見地，下面描述中的附圖是本實用新型的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。其中：圖1為本實用新型結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本實用新型側(cè)視結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為本實用新型培養(yǎng)皿槽結(jié)構(gòu)示意圖。圖中；100底座、110支撐腳架、200一號培養(yǎng)板、210梯形凹槽、220固定螺絲、300二哈培養(yǎng)板、310梯形卡塊、400培養(yǎng)皿槽、410限位槽、420限位彈簧、430固定桿、500縱向標(biāo)尺、510橫向標(biāo)尺。具體實施方式為使本實用新型的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對本實用新型的具體實施方式做詳細的說明。內(nèi)蒙古大鼠原代細胞