無細胞蛋白表達技術（CFPS）的操作確實比傳統細胞表達更繁瑣，主要體現在多步驟的體系配置上。實驗者需要精確配制包含裂解物、能量混合物（ATP/GTP）、氨基酸、輔因子（Mg2?、K?）和DNA/mRNA模板的復雜反應體系，且各組分濃度需嚴格優化（如Mg2?濃度波動1 mM就可能導致表達失敗）。此外，裂解物制備本身涉及細胞培養、破碎、離心透析等步驟，若直接購買商業化裂解物（如RTS 100），單次成本可能高達數百元。對于新手而言，反應條件的微調（pH、溫度、氧化還原環境）往往需要多次試錯，增加了實驗難度。合成生物學利用體外蛋白表達構造??無細胞代謝網絡??。定制蛋白表達下調

凋亡因子（如caspase-3）、細菌du su（如白喉du suA鏈）在細胞內表達會引發宿主死亡。體外蛋白表達系統通過無細胞環境規避毒性效應：在添加線粒體膜組分的兔網織紅細胞裂解物中，全長BAX蛋白（21kDa）表達量達0.8mg/mL，并成功模擬其介導的細胞色素C釋放過程（CellDeathDiffer.,2024）。該系統還可表達HIV蛋白酶（活性>95%），用于高通量抑制劑篩選，加速抗病毒藥物開發。真he dan白的糖基化修飾（如抗體Fc段N-糖）是zhi liao性蛋白功能的he xin。傳統體外蛋白表達因缺乏高爾基體，糖基化效率不足5%。突破性方案是在HEK293裂解物中添加重組糖基轉移酶復合體（含GnT-I、GnT-II、FUT8），使曲妥珠單抗的復雜雙觸角糖型比例升至80%（Science,2022）。結合UDP-GlcNAc底物連續補料，糖均一性（G0F:G2F=1:1.2）媲美哺乳細胞表達，為下一代抗體偶聯藥物（ADC）提供新生產路徑。常見蛋白表達下調使用T7 RNA聚合酶合成加帽mRNA，可提升??真核體外蛋白表達??效率。

B淋巴細胞抗原CD19是一種跨膜糖蛋白，為B細胞惡性zhong Liu生物標志物、CAR-T等療法理想靶點，包含單個跨膜螺旋（292-313）、天然信號肽（1-20）、胞外N端結構域（ECD）和胞內C端結構域（ICD）。其ECD有兩個通過二硫鍵連接的免疫球蛋白樣C2型結構域，ICD有多個無序區域。生產CD19，尤其是ECD對開發新的B細胞淋巴瘤Zhi liao方法十分重要。然而，ECD素來有“難表達”的特點，會導致表達滴度低、蛋白質錯誤折疊和聚集，阻礙了對細胞表面分子的詳細分子研究。在本應用中，我們利用eProteinDiscovery系統的可溶性標簽選擇功能和無細胞混合物，在24小時內篩選了192種表達條件，優化了可溶性CD19蛋白的生產（如圖1所示）。我們成功表達并純化了全長CD19、ECD和ICD。篩選完成后，在24小時內將適合條件進行放大，可生產微克級的蛋白質，從而實現了Zhi liao研究所需復雜蛋白質的提效生產。本應用為表達其他具有跨膜結構域、二硫鍵和高度無序區域的“難表達”蛋白質提供了參考。

eProteinDiscovery系統：一種將無細胞蛋白合成與數字微流控相結合的快速蛋白質原型系統傳統的蛋白質表達純化流程十分依賴人工操作，并且往往需要幾周甚至更久。無細胞蛋白表達的興起可將這一時間縮短至十幾個小時，但是仍需要現進行表達載體的制備，體外擴增和高通量蛋白表達然后再進行篩選等多步操作。Nuclera將這些復雜的流程ji he到eProteinDiscovery系統。該系統使用基于數字微流控的智能卡盒、無細胞蛋白質合成和熒光蛋白檢測技術，使研究人員更容易大規模獲取高質量蛋白質。只要將目標蛋白質的序列輸入配套軟件，就可以利用預設融合標簽定制DNA構建體以優化表達，然后將表達載體裝載到機器上，該系統就會通過自動化構建篩選（可同時篩24種構建體x8種無細胞混合物=192種表達條件），在48小時內，根據可溶性、可純化性和純化產量數據確定Zui Jia表達條件，然后放大規模并獲取蛋白質以供下游應用。該工作流程jin需3步，可生產18kDa~300kDa的蛋白質，還更容易地篩選和獲取同源物、直系同源物、突變和異構體。科學家用細菌??進行蛋白表達??來生產胰島素。

無細胞蛋白表達技術在快速響應公共衛生事件和jun shi應用中表現突出。例如，在COVID-19期間，無細胞蛋白表達技術被用于數小時內合成病毒抗原，加速疫苗候選物篩選。美國DARPA支持的“生物制造”項目利用凍干無細胞蛋白表達技術試劑，在戰場環境中按需生產止血蛋白或抗體，實現便攜式、無需冷鏈的即時生物制造。這類場景凸顯了無細胞蛋白表達技術在時效性和環境適應性上的不可替代性。根據應用需求，無細胞蛋白表達技術可整合非天然氨基酸（通過修飾tRNA）、脂質體（用于膜蛋白表達）或翻譯后修飾酶（如糖基化酶）。通過體外蛋白表達，只需在裂解物中添加對應mRNA，就能在裂解物中安全實現dusu合成及機制研究。定制蛋白表達下調

添加納米盤磷脂的 ?GPCR體外蛋白表達??系統，功能性受體得率提升至80%。定制蛋白表達下調

體外蛋白表達正在推動 無細胞合成生物學 的范式革新：人工代謝通路重構： 在裂解物中整合多酶級聯反應，利用底物通道效應實現小分子化合物的高轉化率合成；基因振蕩器開發： 通過T7 RNA聚合酶的自調控表達構建分子鐘，模擬細胞周期節律；仿生細胞構建： 將蛋白表達系統封裝于脂質體內，結合ATP再生模塊（如bing tong酸激酶系統）創建可自我維持的人工細胞雛形。這種 “設計-構建-測試”閉環 明顯加速了生物系統的理性設計進程。nuclera 高通量微流控蛋白表達篩選系統可助力體外蛋白表達，如想了解更多信息，歡迎咨詢官方代理商上海曼博生物！定制蛋白表達下調