江蘇內毒素檢測風險評估
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發(fā)布時間：2025-10-07
隨著生物制藥行業(yè)的快速發(fā)展，注射用藥劑、疫苗等制劑及植入性醫(yī)療器械的生產需求激增，直接推動了內毒素檢測試劑的市場需求。然而，傳統(tǒng)內毒素檢測嚴重依賴天然鱟試劑，而全球鱟資源正面臨衰減危機。2021 年 2 月，我國國家林業(yè)和草原局、農業(yè)農村部聯(lián)合公告將鱟科動物列為國家二級保護動物，嚴格限制捕撈配額，導致天然鱟試劑價格持續(xù)上漲，甚至出現(xiàn)關鍵檢測環(huán)節(jié)的供應短缺問題。在此背景下，湖州申科研發(fā)的重組級聯(lián)試劑（rCR）通過基因工程技術實現(xiàn)無動物源性生產，徹底擺脫對鱟血資源的依賴。該試劑支持 “減少、替代、優(yōu)化” 的 3R 動物保護原則，不僅解決了資源受限的行業(yè)痛點，還能保障長期穩(wěn)定供應，為內毒素檢測領域的可持續(xù)發(fā)展提供了理想解決方案。
進行重組級聯(lián)試劑時，不同酶標儀檢測樣本 Onset time 有差異，因信號采集方式和靈敏度不同。江蘇內毒素檢測風險評估
重組試劑（rCR、rFC）是解決 LER 的重要工具，優(yōu)化內毒素檢測性能。重組鱟試劑（rCR）通過基因工程表達 C、B 因子及凝固酶原，剔除 G 因子，完全模擬天然鱟級聯(lián)反應，靈敏度達 0.005EU/mL，與天然方法橋接容易，能避免 LPS 結構變化導致的假陰性；重組 C 因子（rFC）靈敏度 0.005-5EU/mL，性狀穩(wěn)定、均一性好，雖需熒光酶標儀，但對部分 LER 場景（如無蛋白質干擾）適配性強。二者擺脫了天然鱟試劑的局限，為內毒素檢測提供更抗 LER 的選擇，契合行業(yè)技術趨勢。
北京原料藥內毒素檢測商業(yè)化試劑盒重組級聯(lián)試劑（rCR）抗干擾能力強于重組 C 因子（rFC），適配高蛋白、疫苗等復雜樣本檢測。
生物制品（如單抗、疫苗、重組蛋白）注射劑因直接進入人體，對細菌內毒素殘留限值要求嚴苛（通常≤0.5 EU/mg 或更低），檢測面臨基質復雜、干擾物質多等挑戰(zhàn)。樣品中常見的蛋白質、螯合劑、表面活性劑等可能抑制或增強 LAL 反應，需通過預處理消除干擾：如采用稀釋法降低基質濃度、添加中和劑（如 Mg2?）修復反應體系，或使用熱滅活去除蛋白類干擾物。此外，生物制品生產全流程需進行內毒素監(jiān)控，從細胞培養(yǎng)上清、純化中間品到終產品均需檢測，確保工藝去除內毒素的有效性，符合 ICH Q6B 等法規(guī)對 “關鍵質量屬性” 的控制要求。
低內毒素回收（LER）與傳統(tǒng)鱟試劑干擾（抑制 / 增強）在多維度存在差異，準確區(qū)分對優(yōu)化內毒素檢測至關重要。表現(xiàn)上，LER 是內毒素回收率＜50%，傳統(tǒng)干擾是反應抑制或增強；成因上，LER 由螯合劑 + 表面活性劑協(xié)同或蛋白質電荷結合引發(fā)，傳統(tǒng)干擾因 pH、β- 葡聚糖等導致；排除方式上，LER 時間依賴且無法稀釋解決，傳統(tǒng)干擾濃度依賴且可通過稀釋緩解；確認方法上，LER 需通過保存時間研究（HTS），傳統(tǒng)干擾按藥典干擾實驗評估。明確這些區(qū)別能幫助企業(yè)排查內毒素檢測異常，避免誤將 LER 當作普通干擾處理。
內毒素干擾試驗回收率需在 50%-200%，驗證樣品基質不影響內毒素檢出。
在開展內毒素檢測時，樣品的 pH 值與二價離子（Mg2?、Ca2?）水平是影響鱟試劑酶促反應的關鍵因素，直接關系檢測結果的準確性。鱟試劑檢測內毒素依賴絲氨酸蛋白酶的級聯(lián)放大反應，該反應的合適 pH 值范圍為 6.0-8.0，若樣品過酸或過堿，會快速降低酶活性，甚至導致酶徹底失活，進而出現(xiàn)內毒素檢測假陰性。針對這一問題，可使用 0.1N 或更低濃度的 HCl/NaOH 溶液，將樣品 pH 值準確調節(jié)至適宜區(qū)間，為反應提供穩(wěn)定環(huán)境。同時，二價離子是反應必需的輔助因子：Mg2?是內毒素活化鱟試劑的關鍵，缺乏會直接阻斷反應啟動；Ca2?雖參與酶促反應，但濃度過高會反向抑制反應效率。若樣品中含有肝素鈉、EDTA、檸檬酸鈉等螯合劑，會與二價離子結合導致其濃度不足，此時可通過內毒素檢查用水稀釋樣品降低螯合劑濃度，或添加特定二價離子試劑補充，但需嚴格控制離子濃度，避免過度增強反應引發(fā)誤差，確保內毒素檢測能真實反映樣品中的內毒素殘留量。
內毒素檢測方法多樣，影響因素及實驗干擾較多，包括實驗操作步驟、樣品處理等方面。北京原料藥內毒素檢測商業(yè)化試劑盒樣本含內毒素結合物時，可嘗試用分散劑減少抑制，保障內毒素正常檢出。江蘇內毒素檢測風險評估
針對單核細胞活化反應測定法（MAT）通過檢測內毒素的生物活性，有效規(guī)避低內毒素回收（LER）對內毒素檢測的影響。其原理是：熱原（包括被掩蔽的 LPS）活化單核細胞表面的 TLR 受體，釋放 IL-6 等細胞因子，通過 ELISA 檢測 IL-6 濃度，結合標準曲線推算熱原含量。即使 LPS 因 LER 改變超分子結構，只要仍具生物活性，就能被 MAT 法識別。這種 “檢測活性而非結構” 的特性，使 MAT 法成為 LER 場景下內毒素檢測的重要補充，與其他方法協(xié)同構建高效可靠的熱原防控體系。
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