上海血液制品熱原檢測合規(guī)申報(bào)
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發(fā)布時(shí)間：2025-10-08
單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定（MAT）是近年來熱原檢測領(lǐng)域的突破性技術(shù)，其原理基于人體免疫系統(tǒng)對熱原的天然應(yīng)答機(jī)制：人源單核細(xì)胞（如 THP-1 細(xì)胞系或新鮮人全血單核細(xì)胞）在熱原刺激下，會活化胞內(nèi)炎癥信號通路，釋放 IL-6、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子，通過 ELISA 檢測細(xì)胞因子的濃度，即可間接反映樣品中熱原的總量與活性。與傳統(tǒng)檢測方法相比，MAT 法具備三大不可替代的優(yōu)勢：一是廣譜性，可同時(shí)檢測細(xì)菌內(nèi)毒素、病毒、真菌毒素、支原體等所有類型熱原，填補(bǔ)了鱟試驗(yàn)法只能檢測內(nèi)毒素的 “非內(nèi)毒素?zé)嵩^(qū)”，尤其適用于疫苗、基因治療產(chǎn)品等易受多種熱原污染的高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品；二是人源相關(guān)性，采用與人體同源的細(xì)胞模型，檢測結(jié)果更貼近臨床實(shí)際熱原反應(yīng)，避免家兔試驗(yàn)中動物種屬差異導(dǎo)致的誤判；三是高靈敏度，對細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測限可達(dá) 0.0125EU/mL，對非內(nèi)毒素?zé)嵩ㄈ缃湍付嗵恰⑾俨《荆┑臋z測限低至 ng/pg 級，滿足低限值產(chǎn)品的質(zhì)控需求。
與傳統(tǒng)方法相比，MAT 法能更覆蓋各類熱原，保障產(chǎn)品安全性。上海血液制品熱原檢測合規(guī)申報(bào)
單核細(xì)胞系培養(yǎng)的高度可控性，為熱原檢測結(jié)果的可靠性提供關(guān)鍵保障。其培養(yǎng)基配方（如營養(yǎng)成分、血清濃度）可定制，確保細(xì)胞獲取充足營養(yǎng)；培養(yǎng)環(huán)境（37℃、5% CO?、濕度≥90%）可恒定控制，維持細(xì)胞好的活性與 TLR 受體表達(dá)水平，避免因環(huán)境波動導(dǎo)致細(xì)胞功能異常。這種可控性還能防止細(xì)胞遺傳突變與外源污染（如支原體、病毒），確保不同批次單核細(xì)胞系的熱原響應(yīng)一致性，讓熱原檢測結(jié)果批間差異小，符合 GMP 對檢測方法穩(wěn)定性的要求。
北京血液制品熱原檢測MAT試劑盒PBMC（外周血單個(gè)核細(xì)胞）用于 MAT 檢測時(shí)供體差異大，IL-6 釋放波動明顯，標(biāo)準(zhǔn)化難度高于單核細(xì)胞系。
MAT法熱原檢測中，非內(nèi)毒素?zé)嵩∟EP）對照品設(shè)為 “選做”，且試劑盒不默認(rèn)配備，需結(jié)合檢測需求靈活使用，背后有明確的設(shè)置邏輯。首先，試劑盒開發(fā)階段已通過驗(yàn)證（用多種 NEP 配體刺激細(xì)胞），證明其可檢出 NEP，后期實(shí)驗(yàn)是否加入 NEP 對照，只需根據(jù)內(nèi)部管理要求或專業(yè)人員建議確定，無需強(qiáng)制設(shè)置；若產(chǎn)品產(chǎn)線明確無 NEP 污染風(fēng)險(xiǎn)（如只使用革蘭氏陰性菌原料），可刪除 NEP 對照，簡化操作。其次，試劑盒不配備 NEP 對照品，是因不同用戶需求差異大 —— 部分用戶需檢測特定 NEP（如脂磷壁酸），部分需檢測廣譜 NEP，因此提供單獨(dú)購買選項(xiàng)，用戶可按需選擇，避免資源浪費(fèi)。NEP 對照品的主要使用場景包括：一是方法驗(yàn)證階段，用于確認(rèn)試劑盒對 NEP 的響應(yīng)性；二是產(chǎn)品工藝變更后，排查是否引入 NEP 污染；三是歐盟申報(bào)時(shí)，需證明方法可覆蓋 NEP，此時(shí)需加入 NEP 對照品并顯示陽性結(jié)果。若樣品檢測中 NEP 對照品陽性，而樣品檢測陰性，可排除 NEP 污染；若樣品陽性，則需進(jìn)一步鑒定熱原類型。
傳統(tǒng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（BET）只能檢測革蘭氏陰性菌的 LPS，無法識別革蘭氏陽性菌 LTA、真菌酵母多糖、病毒鞭毛蛋白等非內(nèi)毒素?zé)嵩嬖诼z風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，部分樣品（如脂質(zhì)體、表面活性劑制劑）會因內(nèi)毒素吸附導(dǎo)致低內(nèi)毒素回收（LER），BET法難以準(zhǔn)確定量。MAT 法通過單核細(xì)胞表面的多種 TLR 受體（TLR1-TLR10），可識別不同類型熱原：TLR4 識別 LPS、TLR2/TLR6 識別 LTA 與酵母多糖、TLR5 識別鞭毛蛋白、TLR3 識別病毒 dsRNA 等，實(shí)現(xiàn) “全熱原覆蓋”。湖州申科生物熱原檢測試劑盒（MAT法）的驗(yàn)證數(shù)據(jù)顯示，其對不同濃度非內(nèi)毒素?zé)嵩许憫?yīng)：如 0.1-100μg/mL 鞭毛蛋白可檢測到 0.005-0.035EU/mL熱原活性，0.1-10μg/mL LTA 對應(yīng) 0.1-0.7EU/mL 熱原活性，1-100μg/mL 雷西莫特（TLR7/8 配體）對應(yīng) 0.5-3.0EU/mL 熱原活性。此外，MAT法檢測的是熱原的生物活性（而非單純 LPS 含量），可避免 LER 導(dǎo)致的假陰性，為CGT等高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品提供更有保障的熱原檢測方案。
基于人體免疫機(jī)制的 MAT 熱原檢測，為熱原檢測提供了新的可靠途徑。
MAT 試劑盒熱原檢測配套細(xì)胞的質(zhì)量控制，是保障檢測結(jié)果可靠的重要環(huán)節(jié)，需從功能、安全性、穩(wěn)定性三方面建立體系。在功能鑒定上，按歐洲 MAT 法要求，需檢測細(xì)胞的 Toll 樣受體（TLR1-TLR9）表達(dá)情況—確保細(xì)胞能響應(yīng)不同類型熱原（如 TLR4 響應(yīng) LPS、TLR2/6 響應(yīng)脂磷壁酸）；同時(shí)考察細(xì)胞倍增時(shí)間（確保活性穩(wěn)定）、熱原反應(yīng)性（對標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素和非內(nèi)毒素?zé)嵩男盘枏?qiáng)度），確保細(xì)胞具備熱原識別與炎癥因子分泌能力。在安全性檢測上，需驗(yàn)證細(xì)胞無菌（無細(xì)菌、真菌污染）、無支原體、無外源病毒因子（如 HIV、HBV）及分枝桿菌，避免外源污染影響檢測結(jié)果。在穩(wěn)定性考察上，需監(jiān)測不同代次細(xì)胞的熱原刺激敏感性，一般要求細(xì)胞使用代次不超過 20 代，代次過高會導(dǎo)致 TLR 表達(dá)下降、炎癥因子分泌減少，影響檢測靈敏度。湖州申科的配套細(xì)胞還額外通過 Western blot 驗(yàn)證 TLR 受體表達(dá)量，并用不同非內(nèi)毒素?zé)嵩潴w刺激驗(yàn)證響應(yīng)性，形成全維度質(zhì)量控制，確保細(xì)胞適配熱原檢測需求。
熱原檢測采用人外周血單核細(xì)胞（PBMC），優(yōu)勢是天然受體譜系完整，但供體差異導(dǎo)致變異系數(shù)（CV）高達(dá)25%。山西熱原檢測風(fēng)險(xiǎn)評估熱作為一種能引起人體溫異常升高的物質(zhì)，一旦存在于藥品、醫(yī)療器械等產(chǎn)品中，將給患者帶來嚴(yán)重的健康風(fēng)險(xiǎn)。上海血液制品熱原檢測合規(guī)申報(bào)
MAT法熱原檢測中，樣品與細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)長需嚴(yán)格控制，以保障炎癥因子分泌量穩(wěn)定。說明書要求共培養(yǎng) 24 小時(shí)，雖未明確允差，但實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示，±30 分鐘的允差對結(jié)果無明顯影響 —— 細(xì)胞因子（如 IL-6）分泌具有時(shí)間依賴性，24 小時(shí)左右達(dá)到分泌平臺期，半小時(shí)差異不會導(dǎo)致分泌量大幅波動。若實(shí)驗(yàn)室對結(jié)果穩(wěn)定性要求極高（如 QC 放行檢測），建議嚴(yán)格按 24 小時(shí)操作，避免因時(shí)長差異引入誤差；若為預(yù)實(shí)驗(yàn)（如樣品稀釋倍數(shù)摸索），±30 分鐘允差可接受，但需在記錄中注明實(shí)際培養(yǎng)時(shí)長。需注意的是，共培養(yǎng)時(shí)長不可超過 26 小時(shí)或短于 22 小時(shí)：過長會導(dǎo)致細(xì)胞活性下降（炎癥因子分泌減少），過短則未達(dá)分泌平臺期（檢測信號偏低），均可能導(dǎo)致熱原濃度低估。此外，培養(yǎng)環(huán)境需保持穩(wěn)定（37℃、5% CO?），溫度波動會影響細(xì)胞代謝，間接導(dǎo)致共培養(yǎng)時(shí)長的實(shí)際效果偏離，因此需定期校準(zhǔn)培養(yǎng)箱溫度，確保環(huán)境條件一致。
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安徽熱原檢測常見問題分析
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