上海原料藥熱原檢測方法驗證

來源：發布時間：2025-10-08

PBMC（外周血單個核細胞）用于 MAT 熱原檢測時，存在異質性與血源供應兩大關鍵問題。從異質性來看，PBMC 含 12% 單核細胞與 88% 淋巴細胞，且來自不同供體，細胞組成、功能狀態及熱原反應存在明顯差異，導致熱原刺激后 IL-6 釋放量波動大，標準化難度高。血源供應方面，除受獻血者數量、時間及采集血液政策限制外，EP2.6.30 還要求嚴格檢測乙肝、丙肝等標志物，且采集血液、處理、試劑制備全程需無菌操作，流程環節多、復雜度高，遠不及單核細胞系制備簡便，易影響熱原檢測的時效性與穩定性。湖州申科熱原檢測試劑盒（MAT）的單核細胞系無供體依賴性，解決PBMC因免疫狀態差異的結果波動。上海原料藥熱原檢測方法驗證

MAT 法熱原檢測的穩定性需從細胞、試劑、操作、樣品四維度嚴格把控。細胞層面，細胞活性與純度直接決定熱原響應能力，活性不足會減少炎癥因子分泌，純度低則引入雜細胞干擾；細胞批次間一致性也關鍵，TLR 受體表達、倍增時間差異會導致結果波動。試劑與耗材方面，標準品效價需溯源國際標準，避免降解影響標曲；試劑盒中細胞因子需質控，防止外源熱原污染；培養液、緩沖液及無熱原耗材（吸頭、西林瓶）若熱原控制不當，易引發假陽性。操作上，加樣手法要統一（如 8 通道移液器液面一致），孵育需 37℃、5% CO?穩定環境，試劑配制濃度準確，設備（酶標儀、洗板機）定期校準，操作偏差會直接導致異常。樣品層面，自身干擾物質（消除炎癥成分、高鹽）、pH 偏離 6-8 或微生物污染，會抑制細胞活化或引入外源熱原，需針對性預處理。

化學制藥熱原檢測合規申報生物制品的高蛋白、螯合劑基質易對鱟試驗產生抑制，rCR與MAT聯合策略可消除干擾并控制熱原。

MAT 法與傳統家兔法在熱原檢測中，性能差異明顯，MAT 法在準確性、效率與合規性上更具優勢。從結果評判來看，MAT 法以 “加標回收率 50%-200%、供試品濃度 < 規定限值（CLC）” 為合格標準，靈敏度達 0.0125EU/mL，可準確定量熱原濃度；而家兔法只能定性（觀察體溫升高），靈敏度低（約 0.1-0.5EU/mL），易因家兔個體差異（如免疫狀態、應激反應）導致假陰性。從檢測效率來看，MAT 法樣品與細胞共培養 24 小時即可出結果，且可批量檢測（96 孔板一次處理多個樣品）；家兔法需連續觀察 72 小時，每次只能檢測少量樣品，耗時且人力成本高。從合規性來看，MAT 法不使用動物，符合 3R 原則，已被歐盟接受（EP 刪除家兔法）；家兔法因動物實驗屬性，面臨歐盟等地區的法規限制。此外，MAT 法重復性優（復孔 CV 可控制在 30% 以內），家兔法因個體差異 CV 常超 50%，進一步凸顯 MAT 法在現代熱原檢測中的優勢。

歐盟在熱原檢測方法選擇上，以動物保護和檢測準確性為導向，形成明確的法規傾向。首先，歐盟禁止家兔法（PRT 法）這類動物實驗，要求采用替代方法，單核細胞活化試驗（MAT 法）因符合 3R 原則（替代、減少、優化），被納入歐洲藥典（EP2.6.30），成為熱原檢測的主流替代方法。其次，對于鱟試劑法，歐盟雖未禁止（因其屬于鱟血提取而非動物實驗），但出于鱟資源保護考量，推薦使用重組 C 因子法（EP2.6.32），該方法無需依賴鱟血，通過基因工程技術制備試劑，避免資源衰減與生態爭議。此外，美國藥典（USP）和日本藥典（JP）也同步推薦重組試劑（含重組級聯試劑 rCR），形成國際法規協同趨勢。需注意的是，歐盟對熱原檢測的要求是 “重點全場景覆蓋致熱物質”，MAT 法因能同時檢測內毒素與非內毒素熱原，重組 C 因子法因特異性高（無 G 因子干擾），均符合其法規邏輯，而傳統鱟試劑法需額外關注 β- 葡聚糖假陽性問題，復雜基質樣品需加做干擾驗證。

單核細胞活化反應試驗（MAT）利用人源細胞釋放IL-6等因子，可同時檢出病毒、真菌等非內毒素熱原。

PBMC（外周血單個核細胞）的復雜制備流程嚴重制約熱原檢測效率。首先，血源獲取受獻血者數量、時間及采集血液政策限制，無法按需即時獲?。黄浯?，需嚴格執行 EP2.6.30 規定的標志物檢測，增加前期準備時間；再進行采集血液、分離單核細胞、凍存等環節需全程無菌操作，步驟繁瑣且易引入污染風險。相比之下，單核細胞系可工業化培養，制備流程簡單可控，能快速提供合格細胞，避免因 PBMC 制備延誤熱原檢測進度，更適配批量樣品的高效質控。憑借深厚的專業積累，湖州申科生物為行業提供可靠的熱原檢測解決方案。重慶抗體藥物熱原檢測

家兔法是熱原檢測 “金標準”，但操作繁瑣、耗時且需動物設施，存在明顯局限。上海原料藥熱原檢測方法驗證

MAT法熱原檢測中，獲得標準 S 型標曲需通過顯色時機控制與圖形調整實現，確保標曲擬合準確。在顯色時機控制上，加入 TMB 底物后，孔內顏色會逐漸變藍，且隨反應時間加深，當標準品濃度梯度呈現明顯藍色差異（如高濃度孔深藍色、低濃度孔淺藍色）時，即可加入終止液；若儀器含 600nm 波長，可在終止前檢測高濃度標準品的 OD600nm 值，當達到 1.0 左右時終止，此時顯色反應處于線性期，終止后顏色由藍變黃，信號強度約增強 3 倍，易形成 S 型曲線。在圖形調整上，若標曲擬合后未呈現明顯 S 型，可通過調整坐標軸范圍優化—如將縱軸（OD 值）范圍設為 0-2.5，橫軸（熱原濃度）設為對數坐標，突出低濃度區的拐點與高濃度區的平臺區，使曲線更接近 S 型。此外，標曲配制需確保濃度點單獨配制（非連續稀釋），避免高濃度標準品污染低濃度點，導致低濃度區信號異常升高，破壞 S 型曲線形態。通過以上方法，可有效提升 S 型標曲的成功率，保障熱原定量的準確性。

上海原料藥熱原檢測方法驗證

標簽：宿主細胞殘留DNA檢測內毒素檢測宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測熱原檢測支原體檢測

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