傳統(tǒng)熱原檢測方法的局限性十分明顯：鱟試驗(yàn)法只能特異性識別細(xì)菌內(nèi)毒素，對非內(nèi)毒素?zé)嵩耆珶o響應(yīng)；家兔熱原試驗(yàn)雖能篩查全類型熱原，但靈敏度低（檢測限≥5EU/kg），無法檢出微量非內(nèi)毒素?zé)嵩覠o法區(qū)分熱原類型，難以追溯污染源頭；單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定（MAT）的出現(xiàn)有效解決了上述難題，其關(guān)鍵優(yōu)勢在于：基于人源單核細(xì)胞的免疫應(yīng)答機(jī)制，可同時識別所有具備生物活性的熱原（包括內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素），且檢測靈敏度高（對病毒熱原檢測限低至pg級）；檢測周期短（24-48小時），可滿足產(chǎn)品快速放行需求；能通過細(xì)胞因子濃度定量評估熱原活性，避免“無活性熱原”的誤判。

MAT法熱原檢測中，樣品與細(xì)胞共培養(yǎng)時長需嚴(yán)格控制，以保障炎癥因子分泌量穩(wěn)定。說明書要求共培養(yǎng) 24 小時，雖未明確允差，但實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示，±30 分鐘的允差對結(jié)果無明顯影響 —— 細(xì)胞因子（如 IL-6）分泌具有時間依賴性，24 小時左右達(dá)到分泌平臺期，半小時差異不會導(dǎo)致分泌量大幅波動。若實(shí)驗(yàn)室對結(jié)果穩(wěn)定性要求極高（如 QC 放行檢測），建議嚴(yán)格按 24 小時操作，避免因時長差異引入誤差；若為預(yù)實(shí)驗(yàn)（如樣品稀釋倍數(shù)摸索），±30 分鐘允差可接受，但需在記錄中注明實(shí)際培養(yǎng)時長。需注意的是，共培養(yǎng)時長不可超過 26 小時或短于 22 小時：過長會導(dǎo)致細(xì)胞活性下降（炎癥因子分泌減少），過短則未達(dá)分泌平臺期（檢測信號偏低），均可能導(dǎo)致熱原濃度低估。此外，培養(yǎng)環(huán)境需保持穩(wěn)定（37℃、5% CO?），溫度波動會影響細(xì)胞代謝，間接導(dǎo)致共培養(yǎng)時長的實(shí)際效果偏離，因此需定期校準(zhǔn)培養(yǎng)箱溫度，確保環(huán)境條件一致。

MAT 法熱原檢測的關(guān)鍵機(jī)制是 “熱原活化單核細(xì)胞 TLR 受體，觸發(fā)炎癥因子分泌”，TLR 受體的全覆蓋是保障檢測無遺漏的關(guān)鍵。不同熱原需活化不同 TLR 受體：最常見的內(nèi)毒素（LPS）主要活化 TLR4，而革蘭氏陽性菌的非內(nèi)毒素?zé)嵩ㄈ缰妆谒幔┬杌罨?TLR2/6，真菌多糖活化?TLR2/4，病毒核酸活化 TLR3/7/8 等。因此，MAT 試劑盒配套細(xì)胞需具備全覆蓋的 TLR 受體表達(dá)—湖州申科生物通過 Western blot 驗(yàn)證，其 HL-60 細(xì)胞系表達(dá) TLR1-TLR9，可響應(yīng)各類熱原。為進(jìn)一步驗(yàn)證覆蓋能力，申科用不同非內(nèi)毒素?zé)嵩潴w（如脂磷壁酸、酵母多糖）刺激細(xì)胞，結(jié)果顯示所有配體均能誘導(dǎo) IL-6 分泌，且呈良好量效關(guān)系，證明試劑盒可檢出各類熱原。若細(xì)胞 TLR 受體覆蓋不全（如缺失 TLR2），則無法檢測革蘭氏陽性菌的非內(nèi)毒素?zé)嵩?，?dǎo)致漏檢風(fēng)險，因此 TLR 受體的全覆蓋是 MAT 法熱原檢測的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)之一。

熱原檢測MAT法的法規(guī)地位持續(xù)提升，已成為多國藥典認(rèn)可的熱原檢測替代方法。歐洲藥典（EP）是推動 MAT 應(yīng)用的關(guān)鍵力量：通則 2.6.30 明確 MAT 可替代家兔熱原試驗(yàn)（RPT），且能同時檢測內(nèi)毒素與非內(nèi)毒素?zé)嵩?024 年歐洲藥典委員會批準(zhǔn)刪除所有條款中的家兔法，修訂文本將于 2025 年7月1日生效，強(qiáng)制鼓勵使用 MAT 等體外替代方法。美國藥典（USP）<151> 規(guī)定，經(jīng)驗(yàn)證的體外熱原試驗(yàn)（如 MAT）可替代家兔法，且需依據(jù) USP<1225>開展驗(yàn)證；FDA 行業(yè)指南進(jìn)一步明確 MAT 的合規(guī)性。中國藥典 2020 年版通則 9301 將 MAT 列為熱原檢查的補(bǔ)充方法，雖暫未替代家兔法，但明確其適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的全熱原篩查。此外，ISO 10993-1、ICCVAM 等國際標(biāo)準(zhǔn)也優(yōu)先推薦體外熱原檢測模型，全球法規(guī)協(xié)同推動 MAT 成為熱原檢測的主流技術(shù)。

中國藥典對 MAT 法熱原檢測要求 4 復(fù)孔，未明確 CV 限值，需結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)特性合理解讀與操作。藥典不設(shè) CV 限值的主要原因是：MAT 法基于細(xì)胞反應(yīng)，細(xì)胞活性易受環(huán)境微小變化（如溫度、pH）影響，存在天然不穩(wěn)定性，過嚴(yán)的 CV 要求可能脫離實(shí)際；但實(shí)驗(yàn)室可通過積累多批次數(shù)據(jù)，制定內(nèi)部 CV 控制范圍（如定量上下限 CV≤30%、25%），確保檢測重復(fù)性。關(guān)于 3 復(fù)孔的適用性：若長期數(shù)據(jù)顯示 CV 控制良好（如連續(xù) 10 批次 CV<20%），且樣品為中間過程檢測（非 QC 放行），可嘗試 3 復(fù)孔，但需同步設(shè)置加標(biāo)對照，驗(yàn)證結(jié)果可靠性；若為 QC 放行檢測，仍建議按 4 復(fù)孔操作，符合藥典下限要求。對于異常點(diǎn)處理，可采用狄克遜準(zhǔn)則（Q 檢驗(yàn)）等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 —— 如某復(fù)孔 IL-6 檢測值偏離平均值 30% 以上，且無明顯操作誤差（如加樣錯誤），可判定為異常點(diǎn)并剔除，但需在原始記錄中詳細(xì)說明原因，確保數(shù)據(jù)可追溯，避免隨意剔除導(dǎo)致結(jié)果失真。

熱原檢測技術(shù)自 20 世紀(jì)初問世以來，經(jīng)歷了 “動物試驗(yàn)→體外生化檢測→細(xì)胞生物學(xué)檢測” 的三次關(guān)鍵變革，每一次變革均推動檢測效率、準(zhǔn)確性與全面性的提升。20 世紀(jì)初至中期，熱原檢測方法只有家兔熱原試驗(yàn)，通過觀察家兔體溫變化篩查熱原，雖實(shí)現(xiàn)了廣譜檢測，但存在動物成本高、操作繁瑣、靈敏度低、種屬差異大等局限，難以滿足制藥行業(yè)快速發(fā)展需求。20 世紀(jì) 60 年代，鱟試驗(yàn)法（LAL 法）的發(fā)明開啟了熱原檢測的 “體外生化時代”，利用鱟血變形細(xì)胞裂解物的凝血級聯(lián)反應(yīng)檢測細(xì)菌內(nèi)毒素，靈敏度提升至 ng 級，檢測時間縮短至 1-2 小時，迅速成為制藥行業(yè)常規(guī)質(zhì)控方法；但該方法依賴鱟資源，易受 β- 葡聚糖干擾，且只能檢測內(nèi)毒素，無法覆蓋非內(nèi)毒素?zé)嵩?1 世紀(jì)以來，重組技術(shù)與細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動熱原檢測進(jìn)入 “全熱原管控時代”：重組級聯(lián)試劑（rCR）與重組 C 因子試劑（rFC）通過基因工程技術(shù)制備，擺脫對鱟資源的依賴，消除葡聚糖干擾，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)；單核細(xì)胞活化反應(yīng)測定（MAT）利用人源單核細(xì)胞檢測全類型熱原，填補(bǔ)非內(nèi)毒素?zé)嵩瓩z測空白，且結(jié)果更貼近人體實(shí)際反應(yīng)。