浙江干細(xì)胞產(chǎn)品支原體檢測核酸擴增法
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發(fā)布時間：2025-11-12
支原體 NAT 檢測的樣本結(jié)果需結(jié)合 FAM 信號與 VIC 信號的表現(xiàn)綜合判定，同時警惕抑制現(xiàn)象對結(jié)果的影響。若 FAM 信號 2 復(fù)孔有 1 孔以上 Ct<40 且呈有效 “S” 型擴增，VIC 信號 2 復(fù)孔 Ct<40 且呈有效 “S” 型擴增，判定為陽性；若 VIC 信號 2 復(fù)孔 Ct≥40 或無明顯擴增曲線，則為陽性但存在抑制。若 FAM 信號 2 復(fù)孔 Ct≥40 或無明顯擴增曲線，VIC 信號 2 復(fù)孔 Ct<40 且呈有效 “S” 型擴增，判定為陰性；若 VIC 信號同樣 Ct≥40 或無明顯擴增曲線，則陰陽性無法判斷且存在抑制。出現(xiàn)抑制現(xiàn)象需重測，重測仍有抑制時，陽性傾向樣本可適當(dāng)稀釋，陰性傾向樣本需優(yōu)化提取條件。
歐洲藥典（EP）2.6.7 認(rèn)可 NAT 法作為支原體檢測替代方法，需通過檢測限與可比性驗證。浙江干細(xì)胞產(chǎn)品支原體檢測核酸擴增法
2023 年美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）的對比研究得出一個結(jié)論是并非所有商業(yè)化支原體檢測試劑盒都能滿足替代傳統(tǒng)方法的要求，研究對市面上 5 款主流試劑盒（ATCC、梅里埃、賽默飛、羅氏、MB）進行測試，發(fā)現(xiàn)不同試劑盒對不同支原體菌株的檢測靈敏度差異明顯，部分產(chǎn)品無法達到宣稱的≤10 CFU/mL 檢測限（符合歐、日藥典替代培養(yǎng)法的要求）。例如，ATCC 試劑盒對萊氏無膽甾原體、精氨酸支原體的檢測限只為 100 CFU/mL，MB 試劑盒對硬蜱螺原體無法檢出（>1000 CFU/mL）。這一現(xiàn)象表明，試劑盒的檢測性能與支原體菌株特性密切相關(guān)，因此企業(yè)需根據(jù)待測樣品的原輔料來源和檢測目的，對試劑盒進行嚴(yán)格的性能驗證，避免因檢測限不達標(biāo)導(dǎo)致質(zhì)量風(fēng)險。
河北生物制品支原體檢測國產(chǎn)替代支原體檢測結(jié)果判定需結(jié)合 FAM 與 VIC 信號，警惕基質(zhì)抑制導(dǎo)致的誤判。
支原體 NAT 檢測中異常曲線的出現(xiàn)多與操作設(shè)置、耗材使用或?qū)嶒灜h(huán)境相關(guān)，需針對性排查解決。首先需確認(rèn)軟件設(shè)置正確性，對照試劑盒說明書檢查時間、溫度、循環(huán)數(shù)、熒光采集等參數(shù)，尤其需注意關(guān)閉不含 ROX 試劑的參比熒光功能。其次若擴增曲線無抬升卻出現(xiàn) CT 值，需調(diào)整基線范圍，將起點設(shè)為熒光信號穩(wěn)定的循環(huán)數(shù)，終點設(shè)為擴增曲線起峰前一個循環(huán)數(shù)。再者需確保耗材與儀器匹配，避免使用普通 PCR 耗材或與加熱模塊規(guī)格不符的反應(yīng)管，防止熒光傳導(dǎo)不佳或熱傳導(dǎo)不充分。此外，曲線先上升后下降可能是反應(yīng)液蒸發(fā)導(dǎo)致，上機前需檢查八連管管蓋無縫隙，避免液面下降干擾結(jié)果。
取樣量的科學(xué)設(shè)計直接影響支原體檢測的代表性與靈敏度，需結(jié)合樣品總體積、基質(zhì)特性綜合考量。法規(guī)建議：產(chǎn)品總體積大于1000mL的按無菌檢查法取樣，10-1000mL 取總體積的 1%，1-10mL 取 100μL，小于1mL的需采用替代取樣方案。實際檢測中，取樣體積越大，靈敏度越高，但需平衡洗脫液消耗與重復(fù)檢測需求。此外，支原體兼具胞內(nèi)胞外生存特性，只檢測上清會導(dǎo)致漏檢，需采用細(xì)胞裂解等處理方式，確保覆蓋全部污染靶點，提升檢測結(jié)果的真實性。
CAR-T 產(chǎn)品支原體檢測需在放行前快速完成，湖州申科快速版試劑盒 2.5 小時可出結(jié)果。
湖州申科生物構(gòu)建了完整的支原體檢測解決方案，包含支原體 DNA 提取純化試劑盒與檢測試劑盒兩大產(chǎn)品。提取純化試劑盒采用磁珠法技術(shù)，具有回收率高、樣品兼容性強的優(yōu)勢，配合湖州申科 rHCDpurify®前處理系統(tǒng)可實現(xiàn)自動化提取操作，大幅提升檢測效率并減少人為誤差。檢測試劑盒采用 PCR - 熒光探針法，覆蓋近200種支原體 DNA 序列，檢測專一性強，且對不同品牌 PCR 儀器具有良好的適用性，性能穩(wěn)定可靠。產(chǎn)品規(guī)格明確，提取試劑盒可處理 50 個樣品，檢測試劑盒可完成 50 次反應(yīng)，整套體系從樣品前處理到定性檢測形成閉環(huán)，滿足生物制品生產(chǎn)各環(huán)節(jié)的支原體篩查需求。
湖州申科支原體檢測試劑盒通過FDA DMF備案，支持全球藥品申報使用。河北生物制品支原體檢測國產(chǎn)替代支原體檢測取樣需按產(chǎn)品體積設(shè)計，10-1000mL 樣品取總體積 1%，保障結(jié)果代表性。浙江干細(xì)胞產(chǎn)品支原體檢測核酸擴增法
湖州申科的支原體驗證菌株以高穩(wěn)定性與合規(guī)性為重點優(yōu)勢，滿足 NAT 方法驗證需求。菌株來源可靠，均取自國內(nèi)外合規(guī)機構(gòu)驗證菌株標(biāo)準(zhǔn)盤，溯源至美國 ATCC（口腔、肺炎支原體）、中國 CVCC（豬鼻支原體）等正規(guī)保藏機構(gòu)，獲正式商用授權(quán)，標(biāo)定濃度涵蓋 10CFU 與 100CFU。生產(chǎn)環(huán)境合規(guī)，在 BSL-2 生物安全實驗室開展，符合國家生物安全法標(biāo)準(zhǔn)，針對不同菌株特性逐個優(yōu)化生產(chǎn)工藝，涵蓋超 10 種菌株的主代與工作代。質(zhì)控環(huán)節(jié)嚴(yán)謹(jǐn)，采用高靈敏度培養(yǎng)基（液體、固體、半流體），保障菌落易觀察分離與 CFU 計數(shù)準(zhǔn)確性；凍存前后均通過固體平皿培養(yǎng)法測定 CFU，聯(lián)合合規(guī)機構(gòu)建立數(shù)字 PCR 標(biāo)定方法，經(jīng)實驗室間對比驗證，準(zhǔn)確監(jiān)控 GC/CFU 比，確保菌株質(zhì)量達標(biāo)。
浙江干細(xì)胞產(chǎn)品支原體檢測核酸擴增法
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