原料藥內毒素檢測風險評估
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發布時間：2025-12-10
在內毒素檢測的技術體系中，凝膠法與動態顯色法基于不同原理與特性，形成互補應用格局。凝膠法依托鱟試劑與內毒素的凝集反應，實現定性或半定量檢測，其靈敏度覆蓋 0.03EU/ml、0.06EU/ml 等多梯度，60 分鐘即可完成反應；檢測結果依賴肉眼觀察（180° 倒轉判讀凝膠形成），數據需手工記錄，配套 內毒素凝膠法測定儀（恒溫儀） 即可開展，雖自動化程度有限，但操作簡潔，適用于生產環節的快速初篩。與之相比，動態顯色法通過監測反應混合物吸光度或透光率的變化（如達預設檢測值的反應時間、信號增速）實現 定量檢測 ，靈敏度拓展至 5-0.005EU/ml ，60-90 分鐘反應時長雖略長，卻可借助酶標儀或全自動內毒素檢測分析儀完成全流程自動化操作—軟件實時采集數據，契合藥品生產質量管理規范（GMP）對數據追溯與精度的要求。二者各有側重：凝膠法以 “快速定性” 服務基礎防控，動態顯色法憑 “準確定量 + 自動化” 支撐嚴苛質控，共同為內毒素檢測提供靈活適配的技術路徑。
內毒素檢查用水經二次精制，無菌無熱原，避免檢測假陽假陰。原料藥內毒素檢測風險評估
內毒素檢測中，樣品中的蛋白質或酶的修飾作用易破壞鱟試劑的反應體系，導致檢測結果失真。鱟試劑檢測內毒素的本質是一系列絲氨酸蛋白酶的酶促放大過程，若樣品中存在氧化劑、抗氧化劑、蛋白水解劑或專一失活劑，會直接滅活反應所需的酶；而乙醇、苯酚等物質則會導致蛋白質變性，同樣抑制反應進程。例如，某些生物制品中含有的蛋白水解酶，可能提前降解鱟試劑中的蛋白酶，使內毒素無法被正常檢測。為消除這類干擾，需優先限制樣品中抑制物的含量：可采用內毒素檢查用水稀釋樣品，降低抑制物濃度；對耐熱的抑制物（如部分蛋白水解酶），可通過加熱滅活處理（如 56℃孵育 30 分鐘）破壞其活性；若樣品基質復雜，還可使用超濾技術分離內毒素與干擾蛋白質，避免修飾作用對酶促反應的影響，保障內毒素檢測結果的可靠性。
廣東生物制品內毒素檢測技術升級樣本含內毒素結合物時，可嘗試用分散劑減少抑制，保障內毒素正常檢出。
血液制品（如白蛋白、免疫球蛋白、凝血因子）來源于人血漿，內毒素污染風險高，且基質中含大量蛋白質、脂質等干擾物質，檢測難度較大。傳統 LAL 法易受血漿蛋白抑制，需通過預處理去除干擾：如采用三氯乙酸沉淀蛋白、超速離心分離脂質，或使用特定去干擾試劑（如內毒素提取試劑）。此外，血液制品內毒素限值較低，需選用高靈敏度檢測方法（如動態顯色法，LOD=0.005 EU/mL）。檢測過程中需嚴格區分 “內源性內毒素”（血漿中天然存在）與 “外源性污染”，通過工藝優化（如巴氏滅活、納米膜過濾）降低外源性內毒素殘留，保障臨床用藥安全。
內毒素檢測方法驗證需覆蓋多項參數，確保方法可靠：線性范圍需包含樣品預期濃度（如 0.01-10 EU/mL），相關系數 R2≥0.98；準確度通過加標回收率評估，應在 50%-200% 范圍內；精密度包括批內和批間精密度，CV 值均應≤15%；檢測限（LOD）需低于產品限值的 1/2（如限值 0.5 EU/mL，LOD 應≤0.25 EU/mL）；專屬性需證明無干擾物質影響（如 β- 葡聚糖、蛋白質不引發假陽性）。驗證通過后，方法需經實驗室負責人批準方可使用，且定期需進行一次回顧性驗證，確認方法持續有效。
細菌內毒素工作標準品可用于鱟試劑靈敏度復核、干擾試驗，適配凝膠法與光度法實驗。
重組試劑（rCR、rFC）是解決 LER 的重要工具，優化內毒素檢測性能。重組鱟試劑（rCR）通過基因工程表達 C、B 因子及凝固酶原，剔除 G 因子，完全模擬天然鱟級聯反應，靈敏度達 0.005EU/mL，與天然方法橋接容易，能避免 LPS 結構變化導致的假陰性；重組 C 因子（rFC）靈敏度 0.005-5EU/mL，性狀穩定、均一性好，雖需熒光酶標儀，但對部分 LER 場景（如無蛋白質干擾）適配性強。二者擺脫了天然鱟試劑的局限，為內毒素檢測提供更抗 LER 的選擇，契合行業技術趨勢。
鱟試劑靈敏度復核至關重要，存放半年需重測，避免內毒素檢測出現假陰性或假陽性。廣東血液制品內毒素檢測方法驗證細菌內毒素試驗（BET）是用鱟變形細胞裂解物（LAL）測內毒素的體外方法，LAL 測試獲國際藥典推薦。原料藥內毒素檢測風險評估
如何準備樣品進行內毒素檢測呢？測試前，需要根據樣品實際情況進行樣本前處理。大多數樣品只需要稀釋，使用內毒素檢測試劑盒進行測試即可。如果樣品有蛋白酶干擾并導致假陽性結果，建議對樣品稀釋并70°C加熱5-15分鐘進行熱滅活處理。如需要，可以對滅活樣品進行進一步稀釋后檢測。如果樣品可能含有受β-葡聚糖，建議使用抗增液。β-葡聚糖可能來自酵母和纖維素材料。如果樣品中因含有內毒素結合物而存在抑制，可以嘗試使用分散劑。
原料藥內毒素檢測風險評估
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