非動物源熱原檢測規范

來源：發布時間：2025-10-24

PyroSHENTEK^®熱原檢測試劑盒以 “簡化流程、提升效率” 為設計理念，采用即用型細胞，凍存細胞無需離心復蘇培養，復融后可直接與供試品混合共孵育，大幅節省傳統細胞預處理（如調整細胞狀態、鋪板培養）的時間成本。實驗流程清晰可控：只需按要求制備待測供試品與內毒素工作標準品，各取對應體積加入細胞懸液（每孔加樣量明確），經 37℃、5% CO?孵育 24 小時后，離心收集上清并通過 ELISA 法檢測 IL-6 含量，全程可在 24 小時內獲得穩定可靠的檢測結果。這種便捷性尤其適配實驗室高通量檢測需求，減少人員操作步驟的同時，降低了因復雜操作引入的誤差風險，兼顧效率與準確性。

熱原檢測實驗中，標準化培養基與恒定環境讓單核細胞系活性穩定，避免PBMC凍存后的功能衰減。非動物源熱原檢測規范

傳統熱原檢測方法的局限性十分明顯：鱟試驗法只能特異性識別細菌內毒素，對非內毒素熱原完全無響應；家兔熱原試驗雖能篩查全類型熱原，但靈敏度低（檢測限≥5EU/kg），無法檢出微量非內毒素熱原，且無法區分熱原類型，難以追溯污染源頭；單核細胞活化反應測定（MAT）的出現有效解決了上述難題，其關鍵優勢在于：基于人源單核細胞的免疫應答機制，可同時識別所有具備生物活性的熱原（包括內毒素與非內毒素），且檢測靈敏度高（對病毒熱原檢測限低至pg級）；檢測周期短（24-48小時），可滿足產品快速放行需求；能通過細胞因子濃度定量評估熱原活性，避免“無活性熱原”的誤判。

非動物源熱原檢測規范當熱原侵入人體循環系統，單核細胞表面的TLR即刻化身分子雷達，準確捕獲LPS、LTA等外源致熱物。

MAT 試劑盒熱原檢測配套細胞的質量控制，是保障檢測結果可靠的重要環節，需從功能、安全性、穩定性三方面建立體系。在功能鑒定上，按歐洲 MAT 法要求，需檢測細胞的 Toll 樣受體（TLR1-TLR9）表達情況—確保細胞能響應不同類型熱原（如 TLR4 響應 LPS、TLR2/6 響應脂磷壁酸）；同時考察細胞倍增時間（確保活性穩定）、熱原反應性（對標準內毒素和非內毒素熱原的信號強度），確保細胞具備熱原識別與炎癥因子分泌能力。在安全性檢測上，需驗證細胞無菌（無細菌、真菌污染）、無支原體、無外源病毒因子（如 HIV、HBV）及分枝桿菌，避免外源污染影響檢測結果。在穩定性考察上，需監測不同代次細胞的熱原刺激敏感性，一般要求細胞使用代次不超過 20 代，代次過高會導致 TLR 表達下降、炎癥因子分泌減少，影響檢測靈敏度。湖州申科的配套細胞還額外通過 Western blot 驗證 TLR 受體表達量，并用不同非內毒素熱原配體刺激驗證響應性，形成全維度質量控制，確保細胞適配熱原檢測需求。

中國藥典與歐洲藥典對 MAT 熱原檢測的細胞類型及復孔數有明確要求，且存在細節差異。細胞類型上，兩者均認可人全血、PBMC（外周血單個核細胞，至少 4 個供體，歐洲藥典建議 8 個供體），中國藥典明確將單核細胞系納入，歐洲藥典則要求單核細胞系需做支原體污染檢測、細胞鑒別等；檢測方法均為 “熱原刺激細胞 + ELISA 檢測 IL-6/IL-1β/TNF-α”。復孔數方面，兩者均規定平行孔≥4、濃度點≥4，中國藥典額外要求標曲 r≥0.90，主要目的是通過多重復孔抵消 PBMC 的不穩定性，確保熱原檢測結果準確可靠。

熱原進入血液后，TLR信號迅速活化NF-κB通路，驅動單核細胞釋放IL-1β、IL-6、TNF-α因子風暴。

PBMC（外周血單個核細胞）用于 MAT 熱原檢測時，存在異質性與血源供應兩大關鍵問題。從異質性來看，PBMC 含 12% 單核細胞與 88% 淋巴細胞，且來自不同供體，細胞組成、功能狀態及熱原反應存在明顯差異，導致熱原刺激后 IL-6 釋放量波動大，標準化難度高。血源供應方面，除受獻血者數量、時間及采集血液政策限制外，EP2.6.30 還要求嚴格檢測乙肝、丙肝等標志物，且采集血液、處理、試劑制備全程需無菌操作，流程環節多、復雜度高，遠不及單核細胞系制備簡便，易影響熱原檢測的時效性與穩定性。歐洲藥典已正式廢除家兔法熱原檢測，推薦單核細胞活化反應試驗（MAT）為合適的替代方案。廣東熱原檢測流程

研究建立體外熱原檢測替代方法以替代家兔法，符合3R理論，是熱原檢測國際趨勢，受各國藥監機構重視。非動物源熱原檢測規范

PBMC（外周血單個核細胞）的供體差異會直接導致熱原檢測結果的波動，主要體現在 IL-6 釋放水平的不一致。不同供體的 PBMC，其單核細胞比例、TLR 受體表達量、免疫活性狀態存在差異：有的供體 PBMC 受熱原刺激后， IL-6 釋放量高；有的則極低，甚至無明顯響應。實驗數據顯示， PBMC 的標曲各濃度點相對偏差有高達 171.43%的，正是這種差異的體現，導致熱原檢測結果難以標準化，無法準確判斷供試品熱原是否超標，從而增加了藥品的質量控制風險。

非動物源熱原檢測規范

標簽：內毒素檢測支原體檢測熱原檢測宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測宿主細胞殘留DNA檢測

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